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感受态细胞

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感受态细胞

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感受态细胞 用途与合成方法

概述

感受态细胞(Competent Cell):理化方法诱导细胞,使其处于最适 摄取、容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大 ,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态 细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。感受态细胞的制 备和转化是分子生物学实验最基本、最常用的操作技术之一,可用于重组质粒 的转化、基因克隆以及基因文库构建等研究。

简介

感受态细胞的制备是基因重组中一项基本技术,是获得高质量基因文 库的关键。由于诱导细菌进入感受态的机制尚不完全清楚,且感受态细胞的转 化率受诸多因素的影响,实验室之间差异较大。尤其在室温较高时,感受态制 备的效果很不稳定,摸索高温季节制备高效感受态细胞的方法仍十分必要。此 外,高效感受态细胞贮存不当会很快丧失其感受性,如何较好地贮存感受态细 胞亦是一个亟待解决的问题。制备感受态细胞的方法很多,而CaCl2法是目前 实验室制备感受态细胞较为常用的方法之一。   感受态细胞图
感受态细胞转化图
图: 感受态细胞及转化过程图

实验方法

CaCl2法感受态细胞制备: 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E.coliDH52单菌落接种于5 mL LB液 体培养基中,37 ℃下振荡培养2~3 h,到OD600= 0.5左右,然后分装成50 mL /份的培养液8份。 感受态细胞制备 将培养液转入大离心管中,冰上放置10 min,然后于4 ℃下 5000 r/min离心10 min;弃上清,用预冷的各浓度CaCl2溶液10 mL分别轻轻悬 浮各管细胞,冰上放置20 min后,4 ℃下5000 r/min离心10min;弃上清,各 离心管中分别加入4 mL预冷的含15%甘油的各浓度CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞, 冰上放置5 min;制备的感受态细胞悬液分装成200 uL的小份贮存于-70 ℃。 转化  将质粒DNA稀释成适当浓度(25 ng /uL),在1.5 mL离心管中,加入1 uL质粒DNA和100 uL感受态细胞混匀,冰浴静置30 min,然后放42 ℃水浴中热 刺激90 s,立即放冰浴冷却3~5 min,另一组是不加质粒DNA的对照组;加900 uL LB液体培养基到转化的感受态细胞中混匀,在37 ℃培养45 min,取适量转 化细胞(100 uL)涂布Amp的LB平板,在37 ℃培养16~24 h后计算长出Amp抗性 菌落数。8个不同浓度CaCl2处理制备的感受态细胞。转化效率= [稀释度×转 化子数×转化原液体积/涂布菌液体积] /DNA量(ug)。

保存

对不同保存时间大肠杆菌感受态细胞转化效率进行比较和差异显著性 分析可以看出:大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存前期随保存时间增加呈上 升趋势,达到最大值后随保存时间增加而呈下降趋势。4 ℃保存于DMSO中的大 肠杆菌感受态细胞转化效率在保存1 d时达最大值(每μg DNA转化子数为4.18 ×108),转化效率比制备时增加了29.07倍,显著高于其他处理在保存1 d时的 转化效率;4 ℃保存于甘油中的大肠杆菌感受态细胞转化效率在保存7 d时达 最大值(每μg DNA转化子数为1.17× 109),转化效率比制备时增加了83.17倍 ,显著高于其他处理在保存7 d时的转化效率;4 ℃条件保存50 d的大肠杆菌 感受态细胞转化效率为0。在- 40 ℃和- 70 ℃保存下,大肠杆菌感受态细胞 的转化效率都在第7天达最大值,比制备时至少增加了21.88倍;保存50 d的大 肠杆菌感受态细胞转化效率也可达每μg DNA转化子数0.62× 107以上。

参考文献

[1]王世伟,李旭业,张伟伟. 优化感受态细胞制备方法提高转化效率的研究 [J]. 齐齐哈尔大学学报,2009,(02):86-90.
[2]唐颜苹,王小媚,何薇,李晓华. 大肠杆菌感受态细胞保存条件的研究[J]. 华中农业大学学报,2008,(06):745-748.
[3]王友如. CaCl_2浓度对感受态细胞转化效率的影响[J]. 湖北师范学院学报 (自然科学版),2006,(03):30-32.
[4]罗婵,汤刚彬,谢体三,石德顺. 感受态细胞制备与保存方法的比较研究[J]. 生物技术,2005,(01):52-54.

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