辣根过氧化物酶的制备方法

背景及概述^[1][2]

辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）是由酶蛋白和铁卟啉结合而成的一种糖蛋白，该酶由多个同功酶组成，分子量为40kDa，等电点为pH3.0‑9.0。HRP的辅基和酶蛋白吸收光谱分别在403nm和275nm，所以人们通常采用RZ值（即OD403nm  /OD275nm的比值）来表示该酶的纯度， RZ值越大，纯度越高。

辣根过氧化物酶是最重要的医疗诊断用酶之一，该酶不但用于多个生化检测项目，还广泛运用于免疫类试剂盒。除此之外，辣根过氧化物酶还可用于工业废水的脱色，过氧化物的去除以及含酚污水的处理等。

在自然界中，辣根是辣根过氧化物酶含量最高的植物，因此也成为生产HRP最具吸引力的原料。

制备方法^[1]

从辣根中提取辣根过氧化物酶的方法，步骤：

（1）取1.0kg新鲜的辣根，用蒸馏水洗净，切成5mm左右的小块，在1.5L 100mM的Tris‑HCl缓冲溶液下匀浆，用1M的HCl调匀浆液pH值为5.0；

（2）将步骤（1）得到的匀浆液在4oC下充分搅拌8小时，离心取上清液1.21L。离心条件为：4oC，8000g，25min；

（3）利用截留分子量为70kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（2）获得的1.21L上清液进行超滤分离，获得滤出液0.96L。分离条件：进口压力0.3MPa，出口压力0.2MPa，流速1.4L/h；

（4）利用截留分子量为30kDa的平板式超滤膜（聚醚砜材质，0.09m2）对步骤（3）获得的0.96L滤出液进行超滤浓缩，获得截留液0.24L。分离条件：进口压力0.4MPa，出口压力0.5MPa，流速1.1L/h；

（5）将步骤（4）获得0.24L截留液冷冻干燥后，得HRP1.63g，经SDS‑PAGE电泳分析，HRP纯度为91%。

含量监测^[2]

步骤一、配制浓度为3×10-4mol/L的邻苯二酚溶液、浓度为2×10-4mol/L的过氧化氢溶液、浓度为37.8μg/mL的石墨烯量子点溶液。

步骤二、先将步骤一制得的邻苯二酚溶液、过氧化氢溶液、石墨烯量子点溶液各取100μL混匀，再加入300μL浓度为0.05mol/L、pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液并在常温下混合40min，重复四次得到添加液共四份。利用辣根过氧化物酶冻干粉和超纯水配制成浓度为1000U/L的辣根过氧化物酶原液，再分别量取不同体积的辣根过氧化物酶原液置于不同的容器中，然后分别向这四个装有不同体积辣根过氧化物酶原液的容器中均加入浓度为0.05mol/L、pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液进行稀释至1mL，得到不同浓度辣根过氧化物酶溶液。量取不同浓度辣根过氧化物酶溶液各100μL，分别向不同浓度的辣根过氧化物酶溶液中加入四份添加液，一种浓度的辣根过氧化物酶溶液中加入了一份添加液，最后向这些含不同浓度辣根过氧化物酶溶液中分别加入100μL浓度为37.8μg/mL的石墨烯量子点溶液后在常温下反应1min，制得等体积不同辣根过氧化物酶浓度的标准溶液，标准溶液中辣根过氧化物酶的浓度分别为0U/L、2.4U/L、4.8U/L、9.6U/L；

步骤三、将步骤二制得的四个标准溶液分别用型号为RF-6000的荧光分光光度计在380nm的激发波长、5nm的激发和发射狭缝的条件下检测荧光强度F，同时取辣根过氧化物酶的浓度为0U/L的标准溶液的荧光强度作为F0。

步骤四、以F/F0为纵坐标、以不同标准溶液中辣根过氧化物酶的浓度为横坐标绘制如图2所示的标准曲线，从荧光光谱图可得知石墨烯量子点探针的荧光强度随辣根过氧化物酶浓度增加而减弱，且荧光强度的降低值与辣根过氧化物酶浓度有良好的线性关系，其中相关系数R2＝0.991，线性方程为F/F0＝0.96×c辣根过氧化物酶-0.08；

步骤五、量取辣根过氧化物酶浓度未知的待测溶液100μL，先向其中加入邻苯二酚溶液、过氧化氢溶液各100μL，再向其中加入100μL浓度为37.8μg/mL的石墨烯量子点溶液和300μL浓度为0.05mol/L、pH为7.4的Tris-HCl缓冲溶液，最后用荧光分光光度计在380nm的激发波长下检测荧光强度，将检测得到的待测溶液的荧光强度带入步骤四中的线性方程，即可计算出待测溶液中辣根过氧化物酶的浓度。

本方法对辣根过氧化物酶的浓度检测限可达到0.83U/L，另外在进行荧光检测过程中，所用的发射光波长从300～400nm间取过多个数值进行实验，最终确定使用波长在380nm的激发光得到的荧光光谱效果。

主要参考资料

[1] [中国发明,中国发明授权] CN201210112799.4 超滤提取辣根过氧化物酶的方法

[2] [中国发明] CN201910385813.X 利用石墨烯量子点作为荧光探针检测辣根过氧化物酶浓度的方法