利用谷棒菌从酪氨酸生物合成圣草酚

圣草酚是一种羟基化黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类水果、蔬菜和许多药用植物中，具有抗氧化、抗炎和神经保护作用，因此有用于制药、营养品或食品工业的潜在价值。目前，获得圣草酚的主要途径是从植物中提取或化学合成。而使用工程微生物生产圣草酚具有不受季节变化影响、最终产品纯度高、生产速度快等优势，因此该研究尝试改造谷氨酸棒杆菌来生产圣草酚。

在植物中，圣草酚生物合成途径从L-酪氨酸开始，在酪氨酸解氨酶(TAL)、4-香豆酰辅酶A连接酶(4CL)、查尔酮合酶(CHS)、查尔酮异构酶（CHI）催化下合成圣草酚的重要前体柚皮素。最后，柚皮素通过类黄酮3'-羟化酶(F3'H)转化为圣草酚（图1A）。

研究内容

首先，该研究将由TAL、4CL、CHS和CHI组成的柚皮素生物合成途径以单顺反子的形式引入谷氨酸棒杆菌中（图1B），TAL来源于Rhodotorula glutinis，其他三个基因则尝试了不同来源的组合优化，其中，来源于Petroselium crispum（Pc）的4CL、来源于Petunia hybrida(Ph)的CHS和来源于Medicago sativa(Ms)的CHI三者组合的效果（图2）。

CHS催化香豆酰辅酶A的转化需要丙二酰辅酶A作为共底物（图1A），其丰度对柚皮素的生产至关重要。为了为柚皮素的生物合成提供足够量的丙二酰辅酶A，该研究将丙二酸转运蛋白基因matC和能将丙二酸转化为丙二酰辅酶A的丙二酰辅酶A合酶基因matB引入谷氨酸棒杆菌中。培养基中补充2 g/L丙二酸钠的条件下，发酵48小时后柚皮素达到最高滴度（17.96 mg/L），比没有MatBC的菌株提高了83%。

接下来，该研究进行了柚皮素合成圣草酚途径的构建，由于来源于植物的P450羟化酶异源表达困难，因此选择了来源于大肠杆菌的HpaBC引入谷棒菌中来催化柚皮素到圣草酚的羟化反应。基因hpaB和hpaC在启动子Ptac的控制下以单顺反子形式组装在质粒pEKEx3-MatBC上。在0.5 mM的IPTG的诱导下，成功的在培养基中检测到了圣草酚的存在，表明异源的HpaBC在谷棒中有效。但只有少部分柚皮素被转化，表明需要进一步优化工艺。

为了提高圣草酚的产率，该研究尝试优化了几个关键的发酵条件，包括接种量、溶解氧、IPTG浓度、碳源、氮源和酪氨酸添加时间。首先将种子培养物以0.5%至7.5%的不同比例接种到AMM培养基中，其中1.5%的接种量效果，并以此接种量进行后续实验。

随后，进行了IPTG加入量的优化（0.1到1.5 mM），其中0.5 mM的诱导效果，后续实验也继续采用该浓度进行诱导。

接下来，该研究在100 mL摇瓶中添加10至30 mL的培养基来验证不同溶氧对圣草酚产率的影响，结果显示发酵体积为10 mL时柚皮素和圣草酚的产率最高。

以前的文献报道，黄酮类化合物的存在可能会导致细胞损伤，为了尽量减少可能的负面影响，该研究探究了在添加IPTG诱导后不同时间点添加底物酪氨酸来延迟柚皮素和圣草酚的产生。然而，结果显示同时添加酪氨酸和IPTG时，柚皮素和圣草酚的滴度最高，可能谷棒本身对黄酮类化合物的耐受性较高，无需延迟补充酪氨酸。

该研究进一步探究了碳源和氮源对圣草酚生产的影响。在测试的四种碳源中（果糖、蔗糖、葡萄糖、乙酸钠），使用葡萄获得了最高的柚皮素和圣草酚产量。测试的氮源是2 g/L的蛋白胨或酵母提取物，结果显示在48小时后，以蛋白胨为氮源的培养基获得了最高的圣草酚产量（14.1 mg/L）。

综上所述，发酵条件为：以葡萄糖为碳源，蛋白胨为氮源，在10 mL培养液中以1.5%接种量接种，在发酵7 h同时添加0.5 mM的IPTG和底物酪氨酸。与未优化的发酵系统相比，这种优化将谷氨酸棒杆菌的圣草酚产量提高了一倍。

该研究首次通过大肠杆菌hpaBC的功能表达实现了谷氨酸棒状杆菌中圣草酚的生物合成，为其他复杂类黄酮化合物的生物合成提供了底盘菌株。证明了谷氨酸棒杆菌作为宿主微生物在酪氨酸生物合成高值化合物中的潜在应用价值。